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  西南醫(yī)科大學(xué)發(fā)文：發(fā)現(xiàn)肝癌治療新靶點(diǎn)
  
  2024-08-08 來(lái)源：轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)網(wǎng)
  
  8月6日，西南醫(yī)科大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)在期刊《Molecular Cancer》上發(fā)表了研究論文，題為“Circular RNA ACVR2A promotes the progression of hepatocellular carcinoma through mir-511-5p targeting PI3K-Akt signaling pathway”，本研究采用定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)或蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)測(cè)定circACVR2A、微小RNA (miR511-5p)和PI3K-Akt信號(hào)通路中相關(guān)蛋白的豐度。分別采用CCK-8、遷移實(shí)驗(yàn)和Tunel染色分析細(xì)胞活力、侵襲和凋亡。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)評(píng)估了circACVR2A與microRNA的相互作用。circACVR2A在肝癌細(xì)胞株中高表達(dá)。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，circACVR2A促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。在機(jī)制方面，研究人員發(fā)現(xiàn)circACVR2A可以直接與miR511-5p相互作用，并作為miRNA海綿調(diào)節(jié)PI3K-Akt信號(hào)通路中相關(guān)蛋白的表達(dá)。在HCC中，circACVR2A可通過(guò)介導(dǎo)miR-511-5p/mRNA網(wǎng)絡(luò)激活PI3K信號(hào)通路。這表明，以circACVR2A為核心的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)是肝細(xì)胞癌診斷和治療的潛在新靶點(diǎn)。
  
  研究背景
  
  肝細(xì)胞癌極其致命，每年有70多萬(wàn)人死于肝癌。我國(guó)每年約有40萬(wàn)新發(fā)肝細(xì)胞癌患者，約占全球新增肝細(xì)胞癌患者的50%。由于肝細(xì)胞癌患者的高復(fù)發(fā)率和不良預(yù)后，尋找新的、更有效的生物標(biāo)志物作為肝細(xì)胞癌的檢測(cè)靶點(diǎn)，或作為預(yù)防和治療靶點(diǎn)顯得尤為必要。
  
  研究表明，circRNA在多種惡性腫瘤與正常組織之間存在穩(wěn)定的表達(dá)差異，因此有學(xué)者認(rèn)為部分circRNA可作為惡性腫瘤的理想生物標(biāo)志物。circRNA還參與腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移等生理過(guò)程。例如，hsa_circ_002059在胃癌、正常組織和血液樣本中的表達(dá)存在顯著差異，也顯示出其作為生物標(biāo)志物的潛在診斷價(jià)值。circ-ITCH在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)明顯低于癌旁組織。過(guò)表達(dá)circ-ITCH可顯著抑制腫瘤細(xì)胞周期進(jìn)展，從而抑制腫瘤生長(zhǎng)。然而，目前關(guān)于circRNA是否可以作為肝癌的診斷和治療靶點(diǎn)的研究較少。
  
  circACVR2A可促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖
  
  研究人員通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)探究circACVR2A是否影響肝癌細(xì)胞增殖。在過(guò)表達(dá)或敲低circACVR2A的肝癌細(xì)胞株Huh-7和Hep3B中，CCK8分別在0 h、24 h、48 h、72 h和96 h檢測(cè)細(xì)胞活力。與對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)circACVR2A可顯著增強(qiáng)肝癌細(xì)胞Huh-7和Hep3B的細(xì)胞活力，而敲低circACVR2A會(huì)導(dǎo)致Huh-7和Hep3B細(xì)胞活力顯著下降。在細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)中，研究人員發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)circACVR2A增加了細(xì)胞克隆的數(shù)量，而沉默circACVR2A則減少了細(xì)胞克隆的數(shù)量，這表明circACVR2A在體外可以促進(jìn)Huh-7和Hep3B細(xì)胞的腫瘤發(fā)生。
  
  circACVR2A可促進(jìn)肝癌細(xì)胞體外增殖
  
  circACVR2A促進(jìn)肝癌的侵襲和遷移
  
  circACVR2A在肝癌細(xì)胞系Huh-7和Hep3B中過(guò)表達(dá)或敲低。研究人員通過(guò)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和體外遷移細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)circACVR2A表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲和遷移的影響。結(jié)果顯示，在遷移實(shí)驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)circACVR2A細(xì)胞的生長(zhǎng)速度明顯快于敲低circACVR2A細(xì)胞的生長(zhǎng)速度。提示circACVR2A可促進(jìn)肝癌細(xì)胞中Huh-7和Hep3B的遷移;侵襲實(shí)驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)circACVR2A能促進(jìn)更多的Huh-7和Hep3細(xì)胞通過(guò)遷移腔室，而敲低circACVR2A會(huì)導(dǎo)致較少的細(xì)胞通過(guò)遷移腔室。提示circACVR2A可促進(jìn)肝癌細(xì)胞中Huh-7和Hep3B的侵襲。
  
  circACVR2A可抑制肝癌細(xì)胞凋亡
  
  研究人員采用TUNEL染色實(shí)驗(yàn)檢測(cè)circACVR2A是否影響肝癌細(xì)胞凋亡。用circACVR2A過(guò)表達(dá)或沉默Huh-7和Hep3B后，制備細(xì)胞片，采用TUNEL染色試劑盒、TdT酶染色液和DAPI酶染色液進(jìn)行染色。通過(guò)熒光顯微鏡觀(guān)察并拍照，根據(jù)TUNEL染色結(jié)果。TUNEL陽(yáng)性染色呈紅色，形態(tài)和大小不一，以分散的形式隨機(jī)分布于正常細(xì)胞中。對(duì)照組幾乎無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞，過(guò)表達(dá)circACVR2A組幾乎無(wú)提示凋亡的紅色陽(yáng)性細(xì)胞，兩組細(xì)胞間無(wú)明顯差異。而在敲低circACVR2A組(shRNA1和shRNA3)中，陽(yáng)性細(xì)胞顯著增加，且高于各自的對(duì)照組。這提示抑制circACVR2A可促進(jìn)Huh-7和Hep3B細(xì)胞的凋亡。
  
  circACVR2A可激活PI3K信號(hào)通路
  
  為進(jìn)一步驗(yàn)證circACVR2A可通過(guò)PI3K信號(hào)通路發(fā)揮致癌作用，研究人員采用蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)Huh-7和Hep3B細(xì)胞株過(guò)表達(dá)和沉默circACVR2A后PI3K信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)circACVR2顯著增強(qiáng)了PI3K、p-PI3K、p-AKT和p-FoxO1的表達(dá)，顯著抑制了FoxO1的表達(dá)，而沉默circACVR2A則呈現(xiàn)相反的結(jié)果。此外，研究人員還檢測(cè)了肝癌細(xì)胞株Huh-7和Hep3B中凋亡相關(guān)蛋白Bax/Bcl2的表達(dá)。在肝癌細(xì)胞株Huh-7和Hep3B中過(guò)表達(dá)circACVR2可顯著抑制Bax的表達(dá)，增強(qiáng)Bcl2的表達(dá)，而沉默circACVR2A后結(jié)果則相反。這表明circACVR2A介導(dǎo)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)可上調(diào)PI3K-AKT信號(hào)通路，發(fā)揮致癌作用。
  
  circACVR2A可促進(jìn)肝癌的體內(nèi)生長(zhǎng)
  
  為了進(jìn)一步驗(yàn)證circACVR2A在體內(nèi)對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響，研究人員構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)circACVR2A和其對(duì)照載體的Hep3B細(xì)胞，并根據(jù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇shRNA1沉默Hep3B細(xì)胞的circACVR2A敲低細(xì)胞。選擇約5-6周齡的裸鼠BALB/c，將過(guò)表達(dá)或敲低circACVR2A及其對(duì)照組的細(xì)胞注射到小鼠右側(cè)腋窩。細(xì)胞接種后一周，各組均出現(xiàn)腫瘤生長(zhǎng)，每3天測(cè)量并記錄腫瘤體積。接種21天后，小鼠被處死，取出腫瘤組織并稱(chēng)重。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，circACVR2A過(guò)表達(dá)組腫瘤組織明顯出現(xiàn)壞死。此外，circACVR2A過(guò)表達(dá)組的腫瘤體積和重量顯著增加，而敲低組的腫瘤體積和重量與對(duì)照組相比顯著降低。研究人員采用HE染色檢測(cè)各組腫瘤的生長(zhǎng)情況。結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)circACVR2A組的腫瘤壞死細(xì)胞面積顯著大于對(duì)照組，而敲低circACVR2A組的腫瘤壞死細(xì)胞面積顯著小于對(duì)照組。這表明在肝癌中下調(diào)circACVR2A表達(dá)可以抑制腫瘤的體內(nèi)生長(zhǎng)。
  
  研究小結(jié)
  
  總之，研究表明，circACVR2A在肝細(xì)胞癌細(xì)胞系中的表達(dá)上調(diào)，其高表達(dá)與肝細(xì)胞癌的進(jìn)展密切相關(guān)。就機(jī)制而言，circACVR2A可通過(guò)直接與miR-511-5p結(jié)合，顯著抑制肝細(xì)胞癌的增殖和轉(zhuǎn)移，從而降低miR-511-5p對(duì)PI3K信號(hào)通路的抑制作用。因此，以circACVR2A為核心的分子調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)可能是治療肝癌的新靶點(diǎn)。
  
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